Botulisma diagnoze balstās uz Clostridium botulīna toksīna noteikšanu laboratorijā un klīnisko simptomu novērošanu, pat ja tie dažkārt nav specifiski. Faktiski šo slimību var sajaukt ar Guillain-Barré sindromu, poliomielītu, insultu, myasthenia gravis un ērču paralīzi.
Pārtikas botulismā svarīgs pavediens ir neiromuskulāro traucējumu un potenciāli piesārņotās pārtikas uzņemšana. Vienlaicīga izpausme vismaz 2 pacientiem, kuri ēda to pašu pārtiku, vienkāršo diagnozi. Apstiprinājums tiek iegūts, izolējot mikroorganismu ar aizdomīgiem pārtikas paraugiem vai pacienta fekālijām, kā arī identificējot botulīna toksīnu pārtikas produktos vai bioloģiskos materiālos (piemēram, asinīs, kuņģa sulā un vemšanā).
Savukārt brūču botulismā to apstiprina seruma toksīna diagnoze vai Clostridium botulinum izolācija no ādas bojājuma parauga.
